Prinsip pewarnaan Gram adalah untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan komposisi kimiawi dinding sel yang berupa peptidoglikan. Perbedaan konsentrasi peptidoglikan pada dinding masing-masing sel bakteri akan memberikan perbedaan warna, sehingga akan mengklasifikasikan / mengelompkkan bakteri menjadi 2 kelompok utama, yaitu kelompok bakteri Gram positif (+) dan Gram negatif (-). Konsentrasi peptidoglikan yang tinggi (tebal) dimiliki oleh kelompok bakteri Gram positif, sedangkan konsentrasi peptidoglikan yang rendah (tipis) dimiliki oleh kelompok bakteri Gram negatif.

Zat kimia yang digunakan dalam pewarna Gram adalah Kristal Violet dan Safranin sebagai pewarna utama yang mewarnai struktur peptidoglikan dinding sel. Kristal Violet akan memberi warna ungu sedangkan safranin akan memberi warna merah pada dinding sel bakteri. Lugols Iodine sebagai mordant penguat ikatan warna. Alkohol sebagi agen penjernih warna (dekolorizer) yang menghilangkan ikatan zat pewarna dengan peptidoglikan.

Bakteri Gram Positif Berwarna Ungu

• Dinding sel bakteri Gram positif mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga kuat mengikat pewarna primer berupa Kristal Violet, setelah diikuti penambahan larutan mordant berupa lugols Iodine.
• Kristal Violet dan Lugols Iodine akan membentuk ikatan komplek dengan peptidoglikan.
• Ketika sudah terbentuk ikatan komplek antara Kristal Violet dan Lugols Iodine, pewarna akan sulit diluruhkan dengan larutan dokolirizer seperti alkohol asam. Peptidoglikan akan tetap mengikat warna kristal violet dan meninggalkan warna biru tua atau ungu.
• Ketika ditambah warna pembanding seperti Safranin, peptidoglikan masih mempertahankan warna primer.

Bakteri Gram Negatif Berwarna Merah

• Dinding sel bakteri Gram negatif tidak mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal (tipis).
• Saat diaplikasikannya pewarna Crystal Violet dan Lugols Iodine tidak dapat membentuk ikatan kuat dengan peptidoglikan.
• Ikatan yang terbentuk antara pewarna dengan peptidoglikan secara mudah diluruhkan atau terbilas oleh larutan dekolorizer
• Alkohol asam akan mendehidrasi dinding sel dan membentuk sebuah pori-pori atau lubang pada membran sel, sehingga akan menghilangkan pewarna primer.
• Pewarna pembanding berupa Safranin mewarnai ulang peptidoglikan yang tidak mengikat lagi pewarna Kristal Violet, sehingga bakteri akan tampak berwarna merah.

Prosedur Pewarnaan Gram

1. Siapkan kultur murni bakteri yang akan diwarnai.
2. Secara aseptis ambil 1 ulasan jarum ose kultur bakteri pada permukaan kaca preparat.
3. Ratakan degan menggunakan akuades steril menggunakan jarum ose.
4. Fiksasi panas dengan cara melewatkan kaca preparat diatas api bunsen sebanyak 3 kali. Fiksasi digunakan untuk mematikan bakteri namun tetap mempertahankan bentuk dan komponen sel.
5. Teteskan peawarna primer (Kristal Violet) secara merata pada ulasan bakteri, dan tunggu selama 20 detik.
6. Bilas pewarna primer menggunakan akuades steril dan tunggu hingga cukup kering.
7. Teteskan larutan mordant (Lugols Iodine) pada permukaan ulasan bakteri, dan tunggu selama 60 detik.
8. Bilas larutan mordant menggunakan akuades steril dan tunggu hingga cukup kering.
9. Teteskan larutan dekolorizer (etanol) secara merata pada ulasan bakteri hingga permukaan ulasan tampak jernih.
10. Bilas larutan dekolorizer menggunakan akuades steril dan tunggu hingga cukup kering.
11. Teteskan pewarna sekunder (Safranin) secara merata pada ulasan bakteri, dan tunggu selama 20 detik.
12. Bilas pewarna sekunder menggunakan akuades steril dan tunggu hingga cukup kering.
13. Setelah kering, tutup permukaan ulasan dengan penutup kaca dan sampel siap diamati dibawah mikroskop.

Interpretasi Hasil Pewarnaan Gram

• https://www.microbeholic.com/2020/08/pewarnaan-gram-prinsip-dan-prosedur-pewarnaan.html
• Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta. 
• Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H and Stahl, D.A. 2015. Brock Biology of Microorganism 14 th edition. Pearson Education, US. 
• Pelczar, M.J dan Chan, E.C.S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta.